液相色譜儀分析肉食品中常見(jiàn)4種抗生素殘留

   大環(huán)內酯類(lèi)與氯霉素類(lèi)藥物是兩類(lèi)應用廣泛的廣普抗生素，由于這兩類(lèi)抗生素能夠有效預防和治療家畜傳染病和寄生蟲(chóng)病的發(fā)生，有些還具有促進(jìn)動(dòng)物生長(cháng)發(fā)育的功用。因此，為了降低養殖成本，提高經(jīng)濟效益，在家畜養殖中廣為使用。但是，近年來(lái)由于在禽畜養殖過(guò)程中過(guò)量使用抗生素又不遵守休藥期的規定，在牛羊肉、豬肉以及雞鴨魚(yú)肉中檢測出了各種抗生素。這種殘留可以通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，進(jìn)而對人體造成各種危害。紅霉素、泰樂(lè )菌素等大環(huán)內酯類(lèi)可致肝損害和聽(tīng)覺(jué)障礙。更嚴重的是長(cháng)期大量濫用廣譜抗生素會(huì )導致腸道微生物菌群被抑制，使人體產(chǎn)生抗藥性，這種抗藥性導致人類(lèi)感染疾病之后治療難度加大，治療成本升高?！　榱吮Ｕ先祟?lèi)的生命健康，世界各國衛生組織以及食品藥品監督管理部門(mén)都已經(jīng)將肉食品中各種抗生素殘留量作了嚴格規定，并且以抗生素在肉食品中的殘留量作為產(chǎn)品進(jìn)口的貿易壁壘，如美國和歐盟對阿維菌素在肉食品中的zui高殘留*為25ug/kg，泰勒菌素為100ug/kg，替米考星為100ug/kg，伊維菌素為40ug/kg。目前肉食品中大環(huán)內酯類(lèi)抗生素常用液一質(zhì)聯(lián)用進(jìn)行全面分析。氯霉素類(lèi)藥物常用氣相色譜及液相色譜分析。而用液相色譜法同時(shí)分析肉食品中兩類(lèi)常見(jiàn)抗生素還未見(jiàn)文獻報道。

   一、LC2100高壓恒流泵：2臺
      uv2100紫外檢測器：1臺 N2000色譜工作站：1臺7725i手動(dòng)進(jìn)樣閥：1套

   色譜工作站：1套 

   二、LC2100液相色譜儀特點(diǎn)

★采用世界上zui的光學(xué)檢測系統（安捷倫液相色譜檢測系統），交差光路設計

★輸液泵單向閥來(lái)源自世界zui的輸液泵技術(shù)

★  傳承了美國瓦里安技術(shù)，確保了泵的可靠性及穩定性

★  檢測器采用了安捷倫科技技術(shù)

★  在國內同行業(yè)真正不需換燈，實(shí)現全波長(cháng)可變檢測分析

★  智能化高，可實(shí)現網(wǎng)絡(luò )化平臺監控，提高了你的QC效益。

★  自動(dòng)化，讓你從繁鎖的分析操作中解放出更多的時(shí)間！

技術(shù)特點(diǎn)

★ 輸液泵單向閥來(lái)源自瑞士進(jìn)口、密封圈來(lái)自美國*、氘燈以及氘燈電源來(lái)自德國*、管路和各種接頭來(lái)源自美國*

★ 泵形式：串聯(lián)雙柱塞 浮動(dòng)式密封圈；泵頭自沖洗功能，泵無(wú)須手動(dòng)排空即可輸液

“自吸式單向閥"技術(shù)，可延長(cháng)密封圈使用壽命；

★ 程序化的溶劑類(lèi)和壓縮因子，可自動(dòng)補償；完整的預清洗功能，更于快速溶劑更換

★ 三條流量校正曲線(xiàn)以及*的多點(diǎn)參數校正，保障了*的流量準確性； 

★ 梯度：高壓2-3元；梯度方式：高壓，梯度洗脫內部軟件可自控制，可通過(guò)PC機及泵控制

★ 紫外檢測器具有自動(dòng)波長(cháng)定位調整，自動(dòng)調零，多量程輸出選擇

★  D2燈（德國原裝）：壽命3500小時(shí)，保證使用2000小時(shí)

  三、高壓恒流輸液泵技術(shù)參數：

四、紫外可見(jiàn)檢測器技術(shù)參數

三、實(shí)驗

　　1 儀器與試劑

　京科瑞達　 LC-2100高壓恒流泵

　　uv2100紫外檢測器

　　超聲波清洗儀　　　　　　　　　　　　　

　　反相色譜柱C18　　

　　固相萃取柱　　　　　　　　　　　　　　　

　　泰樂(lè )菌素、替米考星、氯霉素、氟苯尼考標準品均為天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心監制　

　　乙腈、正己烷均為優(yōu)級純　

　　其它試劑均為分析純　

　　實(shí)驗用水均為二次蒸餾水　

　　新鮮牛肉與雞肉均為超市所購

　　2 色譜條件　　　　　　　　　　　

　　C18反相色譜柱　

　　柱溫25℃，流速1mL/min，進(jìn)樣量25uL，梯度洗脫條件A相為甲醇，B相為0.2mol/L磷酸二氫鈉含10%(體積比)甲醇，調節pH為3.0，梯度洗脫程序：0-2min10%A，2-8min 10%-40%A，8-9min40%-10%A，檢測波長(cháng)入為275nm

　　3 標準溶液的配制及標準曲線(xiàn)的制備

　　分別準確稱(chēng)取各標準品0.01g（至0.001g），用甲醇分別溶解并定容至100mL，配制成100mg/L標準儲備液，于一4℃冰箱中冷藏，測定時(shí)將各標準溶液混合后稀釋成0.1、0.2、0.5、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0mg/L的溶液。分別以泰樂(lè )菌素、替米考星、氯霉素、氟苯尼考峰面積為縱坐標，質(zhì)量濃度為橫坐標繪制標準曲線(xiàn)，計算回歸方程及相關(guān)系數（r）。

　　4 樣品處理

　　將新鮮牛肉及雞肉分別勻漿后，于-18℃冰箱中保存。測定時(shí)，將勻漿冷凍保存的牛肉與雞肉樣品于室溫下自然解凍。分別準確稱(chēng)取20.0g樣品置于50mL具塞錐形瓶中，加入20mL乙腈，超聲10min，轉移至離心管，以5000r/min離心10min，收集上清液，離心沉淀物用上述方法重復提取2次，合并上清液。向得到的清夜中加入30mL正己烷，用力振蕩5min，靜置分層，棄去上層正己烷層。然后將溶液于40℃減壓旋轉蒸發(fā)至約2mL，氮氣吹干后加入5mL甲醇一磷酸鹽混合液超聲溶解抗生素，定容至10mL?！　　?/span>

　　5樣品凈化

　　將HLB固相萃取小柱用5mL甲醇、5mL去離子水活化后，將4得到的樣品處理液上固相萃取柱(柱流速保持1滴/s），用10mL蒸餾水、10mL5%甲醇水溶液淋洗固相萃取柱，再用10mL甲醇洗脫，將洗脫液用氮氣吹干后，加入流動(dòng)相超聲定容至5mL，zui后，經(jīng)0.22um濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣?！　　　?/span>

　　6方法的準確度、精密度、線(xiàn)性范圍、回收率

對于牛肉樣品分別添加0.1、0.5、1.0mg/kg 3個(gè)水平的混合標準溶液，按照4與5樣品處理及凈化方法，每個(gè)水平平行測定4次，進(jìn)行回收率實(shí)驗，并且以3倍信噪比分別計算泰樂(lè )菌素、替米考星、氯霉素、氟苯尼考在牛肉樣品中的檢出限，在測定條件下4種藥物在0.1—20mg/L范圍內均呈線(xiàn)性，線(xiàn)性方程與相關(guān)系數、平均回收率、相對標準偏差見(jiàn)表 　

 7、實(shí)際樣品檢測

本實(shí)驗分別對10份牛肉樣品和10份雞肉樣品中泰樂(lè )菌素、替米考星、氯霉素、氟苯尼考進(jìn)行檢測，沒(méi)有發(fā)現牛肉樣品中含有以上抗生素，但是在4份雞肉樣品中都不同程度檢測到了泰樂(lè )菌素，zui高為200ug/kg，zui低為80ug/kg，平均含量為120ug/kg，高于我國動(dòng)物性食品中獸藥zui高殘留*（100ug/kg）

        我國動(dòng)物性食品中獸藥zui高殘留*規定泰樂(lè )菌素、替米考星、氯霉素、氟苯尼考在肉品中的zui高殘留量（MRL）分別為100、75、1.5、200ug/kg，本實(shí)驗所測泰樂(lè )菌素、替米考星、氟苯尼考的檢出限分別為20、32、16ug/kg均在zui高殘留*以下，符合殘留檢測分析要求。由于氯霉素藥物特殊性，歐盟對氯霉素的檢出限要求為0.1ug/kg，美國FDA對氯霉素的檢出限要求為0.3ug/kg，按照本實(shí)驗方法，氯霉素檢出限為19ug/kg，還未達到上的要求，這是因為提取方法和所用檢測器所致。今后應該發(fā)展更加靈敏的方法以提高氯霉　素。本實(shí)驗方法的平均回收率較高（75%-87%），而且步驟簡(jiǎn)單、操作容易、重現性較好　相對標準偏差為1.35%-5.41%，表明方法穩定可靠。