離心機的使用步驟和使用時(shí)的注意事項有哪些 ?

 

    

離心機是借離心力分離液相非均一體系的設備。根據物質(zhì)的沉降系數、質(zhì)量、密度等的不同，應用強大的離心力使物質(zhì)分離、濃縮和提純的方法稱(chēng)為離心。一般說(shuō)， 離心機轉速在 20 000r/min 以上的稱(chēng)為超速離心。離心技術(shù)，特別是超速離心技術(shù)是分子生物學(xué)、生物化學(xué)研究和工業(yè)生產(chǎn)中*的手段。

   1924 年 T.Svedberg 和 Rinde 研制出世界上*臺渦輪超速離心機以來(lái)，發(fā)展非常迅速，現在已廣泛地應用到科學(xué)研究和生產(chǎn)的各個(gè)領(lǐng)域?，F在離心機轉頭zui高轉速已達 100000 r/min ，zui大離心力達 700 000 g 。

   離心機作為一種手段，具有許多優(yōu)點(diǎn)。例如，超速離心可在低溫下操作，保護了生物大分子的活性。制備型的離心機負載量大，一次可分離提純幾克樣品，比層析、電泳上的樣品量大得多。分析離心機不僅可測物質(zhì)的分子量，還可檢驗物質(zhì)的純度、構象、沉降系數等。因此離心技術(shù)在生物學(xué)研究中占有重要的地位，是分離、純化細胞、病毒、蛋白、核酸和酶的zui方便zui有效的工具。 

   ( 二 )  離心原理

   當含有細小顆粒的懸浮液靜置不動(dòng)時(shí)，由于重力場(chǎng)的作用使得懸浮的顆粒逐漸下沉。粒子越重，下沉越快，反之密度比液體小的粒子就會(huì )上浮。微粒在重力場(chǎng)下移動(dòng)的速度與微粒的大小、形態(tài)和密度有關(guān)，并且又與重力場(chǎng)的強度及液體的粘度有關(guān)。象紅血球大小的顆粒，直徑為數微米，就可以在通常重力作用下觀(guān)察到它們的 

沉降過(guò)程。

   此外，物質(zhì)在介質(zhì)中沉降時(shí)還伴隨有擴散現象。擴散是無(wú)條件的的。擴散與物質(zhì)的質(zhì)量成反比，顆粒越小擴散越嚴重。而沉降是相對的，有條件的，要受到外力才能運動(dòng)。沉降與物體重量成正比，顆粒越大沉降越快。對小于幾微米的微粒如病毒或蛋白質(zhì)等，它們在溶液中成膠體或半膠體狀態(tài)，僅僅利用重力是不可能觀(guān)察到沉降過(guò)程的。因為顆粒越小沉降越慢，而擴散現象則越嚴重。所以需要利用離心機產(chǎn)生強大的離心力，才能迫使這些微?？朔U散產(chǎn)生沉降運動(dòng)。

   離心就是利用離心機轉子高速旋轉產(chǎn)生的強大的離心力，加快液體中顆粒的沉降速度，把樣品中不同沉降系數和浮力密度的物質(zhì)分離開(kāi)。離心力 (F) 的大小取決于離心轉頭的角速度 ( ω ， r/min) 和物質(zhì)顆粒距離心軸的距離 (r ， cm) 。它們的關(guān)系是： F ＝ ω 2R

   為方便起見(jiàn)， F 常用相對離心力也就是地心引力的倍數表示。即把 F 值除以重力加速度 g ( 約等于9.8m/s2.) 得到離心力是重力的多少倍，稱(chēng)作多少個(gè) g 。例如離心機轉頭平均半徑是 6cm ，當轉速是 60 000 

r/min 時(shí)，離心力是 240 000 × g ，表示此時(shí)作用在被離心物質(zhì)上的離心力是日常地心引力的 24 萬(wàn)倍。因此，轉速 r/min 和離心力 g 值之間并不是成正比關(guān)系，還和半徑有關(guān)。同樣的轉速，半徑大一倍，離心力 (g 值 ) 也大一倍。轉速 (r/min) 和離心力 (g 值 ) 之間的關(guān)系可用下式換算：

式中： r 為半徑 (cm) ， g 為離心力 (g 值 )

   （三 ) 超速離心機的離心方法 

   用離心方法分離生物大分子和亞細胞物質(zhì)的基本原理是根據它們在液體介質(zhì)中或者沉降速度不同而形成不同的區帶，或者它們的密度不同而停留在液體介質(zhì)中不同的位置而把它們一一分開(kāi)。前者是沉降速度法，應用該法時(shí)液體介質(zhì)的zui大密度要小于樣品中zui小顆粒的密度，離心時(shí)選用高轉速和短時(shí)間；后者是沉降平衡法，應用該法時(shí)液體介質(zhì)的zui大密度要大于樣品中zui小顆粒的密度，離心時(shí)選用較低轉速和較長(cháng)時(shí)間。實(shí)際操作有幾種形式：

   1. 差速離心這種方法是選擇不同轉速的離心，分別分離各個(gè)不同組分。例如先用低速沉降大顆粒和上清液，在高速離心上清沉降中等顆粒，zui后超速離心上清沉降小顆粒。采用逐級提高離心力分離上情液的方法，把不同大小的顆粒分開(kāi)。

   這種方法比較簡(jiǎn)單，方便。分離的組份沉到管底，因此可以迅速濃縮所要的組份，減少體積。但回收率和純度是有矛盾的，要提高回收率，勢必提高轉速或延長(cháng)離心時(shí)間，這樣大小相近的顆粒也會(huì )沉到管底。因此該法多用于粗提純或初步濃縮樣品。

   2. 速度區帶 ( 或速度梯度 ) 離心 本法是將樣品放在一個(gè)連續的密度梯度液體上，通過(guò)離心，大顆粒沉降快，小顆粒沉降慢。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間，相同的顆粒就在同一深度形成一條帶子，因此把各種組份分開(kāi)來(lái)。它適用于分離密度相同、而大小不同的物質(zhì)，如不同的蛋白質(zhì)組份密度都差不多，但分子量不一樣，用本法很容易將其分 

開(kāi)。但對密度不同、大小類(lèi)似的物質(zhì)則不易分離。蔗糖梯度是一種常用的介質(zhì)。用不同濃度的蔗糖溶液 (5%-60%) 配成梯度，用于梯度離心。再分別進(jìn)行收集處于不同區帶里的各個(gè)組份。